□ 張 帆 陶 濤 王水明 文/圖
“埃博拉病毒檢測(cè)技術(shù)儲(chǔ)備研究”建立的針對(duì)埃博拉病毒及其5種亞型的檢測(cè)方法，為我國(guó)埃博拉病毒防控提供了第一手資料及技術(shù)手段，這將有助于我國(guó)對(duì)出入境貿(mào)易商品中攜帶EBV進(jìn)行科學(xué)評(píng)價(jià)，對(duì)進(jìn)出境人員、易感動(dòng)物進(jìn)出境的EBV預(yù)警防控提供必要的檢測(cè)技術(shù)儲(chǔ)備。
檢測(cè)人員確認(rèn)PCR是首選檢測(cè)技術(shù)
實(shí)驗(yàn)人員對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行照相分析
技術(shù)人員制備被檢樣品
江蘇南京檢驗(yàn)檢疫局主持的江蘇檢驗(yàn)檢疫局科研項(xiàng)目“埃博拉病毒檢測(cè)技術(shù)儲(chǔ)備研究”近日順利通過鑒定。鑒定會(huì)上，鑒定委員會(huì)聽取了課題組的研究工作匯報(bào)，審閱相關(guān)材料并進(jìn)行了質(zhì)詢，經(jīng)評(píng)議后一致認(rèn)為，課題組建立的針對(duì)埃博拉病毒及其5種亞型的檢測(cè)方法，具有良好的敏感性、穩(wěn)定性和重復(fù)性，對(duì)外來(lái)病防控和出入境動(dòng)物產(chǎn)品檢驗(yàn)檢疫具有重要意義，應(yīng)用前景廣闊，其成果達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平。
技術(shù)儲(chǔ)備 刻不容緩
埃博拉出血熱（Ebola haemorrhagic fever，EHF）是由埃博拉病毒（Ebola virus，EBV）引起的急性多器官溶血性疾病，屬于動(dòng)物疫源性傳染病，人的病死率高達(dá)80％，是人類目前已知最為烈性的傳染病之一。由于該病最初是在蘇丹和扎伊爾間的埃博拉河流域發(fā)生，故稱為埃博拉血熱。
EBV通過干擾感染者機(jī)體凝血平衡，導(dǎo)致血管壁破壞或功能受損，血小板不能凝血，在2至21天內(nèi)出現(xiàn)出血性休克或器官衰竭。人感染EBV，主要表現(xiàn)為急性發(fā)熱、肌肉酸痛、頭痛、嘔吐；有出血趨勢(shì)和偶爾的休克癥狀，皮膚丘疹，胃腸道、呼吸道和器官瘀血、出血。由于體內(nèi)器官壞死、分解，病人不斷把壞死組織從口中嘔出，最后多因廣泛性內(nèi)出血、腦部受損等原因而死亡，世界衛(wèi)生組織已將EBV列為對(duì)人類危害最嚴(yán)重的病毒之一。
由于EBV危害程度分類為第一類，其病毒培養(yǎng)、動(dòng)物感染等試驗(yàn)必須在生物安全四級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，未經(jīng)培養(yǎng)的感染材料在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，滅活材料在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。世界上僅有少數(shù)幾個(gè)國(guó)家的實(shí)驗(yàn)室能開展埃博拉病毒的研究，主要集中在美國(guó)亞特蘭大的CDC。我國(guó)在埃博拉出血熱的檢測(cè)研究上還基本上屬于空白。
雖然目前我國(guó)境內(nèi)并沒有出現(xiàn)EHF的暴發(fā)，也不存在EBV。但是由于我國(guó)與外國(guó)貿(mào)易往來(lái)不斷增多，尤其是與非洲各國(guó)的交往比以往更為頻繁，EBV極有可能通過潛伏期病人或者隱性感染者以及感染的動(dòng)物傳入我國(guó)。EHF若暴發(fā)將帶來(lái)難以估計(jì)的危害。加快EBV檢測(cè)技術(shù)的儲(chǔ)備，建立快速、準(zhǔn)確、特異的EBV實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法，對(duì)于口岸衛(wèi)生檢疫、動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品檢疫具有重要意義。檢測(cè)技術(shù)儲(chǔ)備，刻不容緩！
攻堅(jiān)克難 創(chuàng)造領(lǐng)先
得到免疫性良好檢測(cè)抗原，避免使用全病毒所帶來(lái)的巨大風(fēng)險(xiǎn)，首先要制備檢測(cè)抗原。在EBV核酸檢測(cè)時(shí)，一般選擇高度保守糖蛋白（GP）或核蛋白（NP）作為擴(kuò)增靶標(biāo)進(jìn)行設(shè)計(jì)引物或探針，課題組正是在EBV NP序列的5'端非編碼區(qū)的一段高度保守的序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明具有很高的特異性。由于我國(guó)現(xiàn)在還沒有感染EBV的臨床樣品，并嚴(yán)禁EBV的操作，課題組創(chuàng)新性地采用體外合成的辦法獲得目的基因，采用基因摻入法制備被檢樣品，并模擬樣品病毒滅活過程。
選擇適合我國(guó)情況的檢測(cè)方法。國(guó)外報(bào)道建立對(duì)EBV的多種檢測(cè)方法，如病毒分離、電鏡觀察、RT-PCR、Real-time PCR、PCR、ELISA、捕捉ELISA、血凝試驗(yàn)、間接免疫熒光、Western blot等，從現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用結(jié)果來(lái)看，RT-PCR方法具有快速、敏感的優(yōu)點(diǎn)，結(jié)合我國(guó)實(shí)際情況，PCR仍是最理想的首選檢測(cè)技術(shù)。
EBV與多種出血熱病毒有較近親緣性，尤其是馬爾堡病毒（Marburg Virus，MARV）同屬絲狀病毒屬。為了攻克這一難關(guān)，研究小組在EBV NP序列的5'端非編碼區(qū)的一段高度保守的序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，采用特異性較強(qiáng)的套式PCR方法，在經(jīng)歷上百次失敗后，成功設(shè)計(jì)出合適的引物，進(jìn)而經(jīng)過反復(fù)摸索，優(yōu)化反應(yīng)條件，最終成功建立套式RT-PCR方法。該項(xiàng)方法不僅具有良好特異性，能區(qū)分EBV和MARV，而且具有高敏感性，可以檢測(cè)10pg的病毒RNA，將檢測(cè)敏感度提高了1000倍。
病毒亞型之間的同源性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于不同病毒之間，即使是國(guó)際上，目前也僅能對(duì)EBV的扎伊爾亞型、蘇丹亞型和本迪布焦亞型三種亞型進(jìn)行區(qū)分，尚無(wú)檢測(cè)萊斯頓亞型和科特迪瓦亞型方法的報(bào)道。研究組明知山有虎，偏向虎山行。在吸收國(guó)外成功經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合掌握的資料和前期的經(jīng)驗(yàn)，采用Taqman Real-time RT-PCR技術(shù)，成功建立了分別檢測(cè)5種亞型的檢測(cè)方法，其中對(duì)萊斯頓亞型和科特迪瓦亞型的檢測(cè)方法為國(guó)際首創(chuàng)。這一研究成果，不僅填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)外的研究空白，也具有重要的應(yīng)用價(jià)值，對(duì)于疾病的治療、病原的追溯、疾病的防控具有重要意義。
成果初現(xiàn) 走向應(yīng)用
課題組利用建立的檢測(cè)方法，對(duì)緬甸地區(qū)兩個(gè)縣，涉及3個(gè)科，5個(gè)屬的853只蝙蝠進(jìn)行了熒光定量EBV檢測(cè)，結(jié)果全部陰性；共收集全國(guó)15個(gè)�。ㄊ小^(qū)）豬臨床樣品920份，被采集臨床樣品的豬都表現(xiàn)出豬瘟、豬藍(lán)耳病、豬偽狂犬病、豬流感或豬流行性腹瀉病疑似癥狀，對(duì)這些樣品進(jìn)行了EBV RT-PCR檢測(cè)和萊斯頓亞型EBV檢測(cè)，結(jié)果全部為陰性。通過臨床樣品的檢測(cè)，一方面驗(yàn)證了檢測(cè)方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性，另一方面，這是國(guó)內(nèi)首次針對(duì)EBV的流行病學(xué)調(diào)查，這為我國(guó)EBV的防控提供了第一手資料。
課題組在研究過程中，發(fā)表研究論文10篇，研究的“一種檢測(cè)埃博拉病毒的熒光定量PCR檢測(cè)方法及其引物和試劑盒”和“一步法檢測(cè)Z/S亞型埃博拉病毒的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法及其試劑盒”申請(qǐng)國(guó)家發(fā)明專利，目前已成功受理。
該項(xiàng)目研究的5種亞型EBV的RT-PCR檢測(cè)方法、SYBR Green Ⅰ熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法及單獨(dú)檢測(cè)每一基因亞型的EBV熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法適用于大規(guī)模EBV流行病學(xué)調(diào)查，具有簡(jiǎn)單、快速、敏感的優(yōu)點(diǎn)，將為進(jìn)出口動(dòng)物檢疫，EBV易感動(dòng)物監(jiān)測(cè)提供簡(jiǎn)單、快捷的檢測(cè)工具。
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（Ebola virus）又譯作伊波拉病毒，是一種能引起人類和靈長(zhǎng)類動(dòng)物產(chǎn)生埃博拉出血熱的烈性傳染病病毒。埃博拉病毒的名稱出自非洲扎伊爾的“埃博拉河”。
這種病毒來(lái)自“Filoviridae”族，與馬爾堡病毒類似�！鞍２├辈《臼且环N十分罕見的病毒，這種病毒最早是于1967年在德國(guó)的馬爾堡首次發(fā)現(xiàn)的，但當(dāng)時(shí)并沒有引起人們的注意。1976年在蘇丹南部和扎伊爾即現(xiàn)在的剛果（金）的埃博拉河地區(qū)再次發(fā)現(xiàn)它的存在后，才引起醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注和重視，“埃博拉”由此而得名。在大約1500例確診的埃博拉案例中，死亡率高達(dá)88%。目前沒有有效的特效療法，也沒有埃博拉病毒的疫苗。
《中國(guó)國(guó)門時(shí)報(bào)》
